超滤的应用和​超滤膜的选择

 本文以赛多利斯超滤产品线为例介绍了超滤的应用和超滤膜的选择。

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超滤的应用

超滤(Ultrafiltration)是一种膜分离技术,它的特点是使用不对称多孔膜,根据分子的大小来分离溶液中的大分子物质与小分子物质。超滤尤其适用于大分子溶液的浓缩、不同种类分子的纯化以及溶剂交换等。超滤法是一种温和的、非变性的物理方法,比其它分离方法具有效率更高、更灵活的优点。

超滤法的典型应用

  • 对蛋自质、酶、DNA、单克隆抗体、免疫球蛋白进行浓缩和脱盐
  • 药物、激素分析
  • 从PCR扩增的DNA中去除引物
  • 去除标记的氨基酸和核苷酸
  • HPLC样品制备
  • 样品的除蛋白
  • 从生物体液、发酵肉汤培养基中纯化抗生素、激素、药物
  • 从细胞悬液、裂解液中回收生物分子对蛋白质、酶、细胞、DNA、生物分子、抗体和免疫球蛋白进行常规意义的实脸室浓缩和脱盐
  • 哺乳动物细胞的收集
  • 清洗细胞、纯化病毒、去除细胞碎片、除热原

浓缩

使用超滤来增加所需大分子溶质的浓度,即大分子被超滤膜截留而小分子和溶剂可自由通过,从而达到浓缩的目的。

浓缩
浓缩

梯度分离

按分子大小梯度分离样品中的溶质分子时,超滤是一种经济有效的方法,适用于分离分子量相差10倍以上的分子组分。在超滤过程中,虽然截留的大分子被浓缩,但滤过的溶质分子仍保持初始的浓度。

梯度分离
梯度分离

脱盐/纯化

脱盐即从大分子溶液中去除盐、非水性溶剂和小分子物质的过程。通过换缓冲液,可以最有效地去除溶液中的小分子物质,并逐渐分离纯化出大分子物质。具体方法为:在溶液进行超滤的同时,不断向溶液中补充缓冲液,补充缓冲液的速度与溶液滤过速度相同,使体系始终保持恒定,这种方法又称透析超滤法。

脱盐纯化
脱盐纯化

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选择合适的操作方式

用于超滤的操作方式,选择范围非常广泛。选用何种操作方式主要根据样品处理量、实验室现有设备、滤过速度、用户的实验要求等综合指标来决定。

  • 离心

(处理量从100ul到l00ml)

通过离心力,使溶液中的小分子溶质和溶剂透过超滤膜,被收集在滤过液收集管中,而大分子溶质则被超滤膜截留在样品浓缩管中。该方式的特点是操作简便,滤过速度快。

Sartonus提供了10种规格的浓缩离心管,处理量从100ul到l00ml。

  • 加压离心

(处理量从5ml到50ml)

加压离心是Sartorius公司特有的操作方式,将浓缩离心管加压后再放入离心机里离心,比单独离心快30-50%,是最快的浓缩方式。

Vivaspin 20和Vivacell 70也可以按照这种方式进行操作。

  • 加压

(处理量从5ml到250ml)

用压缩空气或惰性气体作为超滤的动力,超滤的同时通过振荡来避免浓差极化,提高超滤速度。Vivaspin 20、Vivacell 70、Vivacell 100和Vivacell 250适用于这种操作方式,加压后静置即可完成超滤。当需要快速超滤时,可在加压后放在摇床上,边振荡边超滤。

  • 切向流

(处理量从100ml到5L以上)

使用蠕动泵送液,溶液沿与超滤膜平行的方向回旋流动,可避免浓差极化,提高超滤速度。

Vivaflow 50和Vivaflow 200是专为这种操作方式设计的。

  • 溶剂吸附

(处理量从1ml到20ml)

该方式在超滤膜后加纤维素吸附垫,以吸附力作为超滤的动力,不需要任何附加设备。溶剂和小分子溶质在吸附力的作用下透过超滤膜,而大分子物质则被截留浓缩。Vivapore是专用于这种操作方式的,有5种规格可供选择,样品处理量从Iml到20ml。

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超滤膜的选择

选择超滤膜主要根据膜的材质、截留分子量以及综合性能等,但是应注意,膜的最终性能还取决于所需进行超滤的溶液的特性,我们建议用户用不同的膜进行试验,以选出最适合的膜。

  • 聚醚砜(Polyethersulfone)
这是一种用于常规目的的滤膜,尤其在回收大分子截留物时,可以得到很好的收率。聚醚砜具有亲水性、高流量以及化学兼容性广泛的特点。
  • 三醋酸纤维素(Cellulose Triacetate)

这种膜亲水性强,非特异性吸附极低,溶剂和小分子溶质在滤过时不会因被膜吸附而产生损失,因此在样品清洗、除蛋白以及其它需要回收滤过液的操作中,建议使用三醋酸纤维素膜。

  • Hydrosart®Hydrosart超滤膜的基本特性与再生纤维素类似,Hydrosart在具有极低的蛋白吸附特性的同时,又具有高流速和高通量的特性,是免疫球蛋白浓缩和脱盐的理想用膜

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不同膜的性能比较

超滤膜 首选应用
聚醚砜超滤膜 pH 1-14
3,000 MWCO,5,000 MWCO,10,000 MWCO,30,000 MWCO,50,000 MWCO,100,000 MWCO
  层析柱洗脱液的浓缩/脱盐
三醋酸纤维素超滤膜 pH 4-8

5,000 MWCO,10,000 MWCO,20,000 MWCO

游离/结合药物研究;滤过液的分析研究
Hydrosart® 超滤膜 pH 1-14
2,000 MWCO,5,000 MWCO,10,000 MWCO,30,000 MWCO
层析柱洗脱液的浓缩/脱盐/Hydrosart®超滤膜可线形放大到生产

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超滤膜选择指南

Sartorius公司的Vivascience系列超滤产品,采用了先进设计和低吸附材质,同时具有超滤速度快和收率高的优点,当超滤器的大小和膜的截留分子

量选择适当时,回收浓度大于0.1mg/ml的溶质,收率可达90%以上。大部分样品损失是由于滤膜表面和样品容器的非特异性吸附引起的。

  • 滤膜吸附

滤膜表面样品的吸附量,与样品的性质以及所选用的滤膜材质有关,一般为2-10 μg/cm2。如果研究的对象是滤过液,由于其滤过时要穿过滤膜的整个内部结构,所以吸附量相对较大,为20-100 μg/cm2。通常截留分子量高的膜吸附较高,而截留分子量低的膜吸附较低。

  • 容器吸附

生产超滤器时,通过选用低吸附材质,精细抛光,已最大限度地降低了吸附性,但仍有一些溶质会被容器内壁吸附。与滤膜吸附相比,这种吸附的比例很小,但当容器内壁的表面积相对较大时,也可能成为产品损失的主要原因。

如何提高收率

当需要较高的收率时,尤其当研究的样品对象在微克范围时,Sartorius建议

用户考虑以下几点:

  • 根据样品处理量,选择最小可用的超滤容器,可以充分利用Vivascience

产品滤过速度快的优势。在小容器中反复添加样品,反复超滤。

  • 在适用范围内,选截留分子量最低的膜。
  • 如果可能,使用水平转头代替角转头离心,这样可减少在离心过程中溶液与离心管接触的表面积。
  • 将压力或离心力降低到大约最大推荐数值的一半。
  • 避免过度浓缩。最终体积越小,越难得到完全回收。如果可能,在第一次回收后,用一滴或多滴缓冲液润洗容器,然后再次回收。
  • 用溶于蒸馏水中的5%SDS、Tween20或TritonX预先浸泡超滤容器过夜,然后在使用前彻底润洗。
超滤膜选择指南
超滤膜选择指南

为了得到最高的收率,所选滤膜的MWCO,要小于或等于所需截留分子大小的一半。

本文转载自上海揽宝公众号.

Millipore Amicon密理博超滤离心管

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